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      免疫细胞化学实验操作指南

      该免疫细胞化学实验方法仅供参考,由于每个实验使用的试剂不同,并且涉及不同的物种,组织类型及实验应用,实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

      所需试剂
      • PBS 洗涤液. 磷酸盐缓冲液 (PBS). 使用 10x PBS, pH 7.2 (0.2M 磷酸钾, 1.5M NaCl). 用适量去离子水稀释到1x.

      • 甲醛固定. 用PBS稀释到 4%.

      • 抗体稀释液. 制备100ml 的PBS 洗涤液,加入1ml 与二抗宿主同物种的正常血清.

      • 生物素化的二抗. 在抗体稀释液中制备生物素化的二抗溶液. 使用抗一抗宿主的生物素化的二抗.

      • 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶. 在PBS缓冲液中制备链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液.

      • DAB 底物.

      • 苏木精复染色以及固定介质.

       

      步骤
      1. 将细胞生长于显微镜载玻片,或盖玻片,或细胞培养板上。除去培养基液,用冰冷的PBS小心清洗细胞3次。用含4%甲醛的PBS溶液于冰上固定细胞30分钟,使用的甲醛溶液应与最初培养基液体积相等。弃去固定液,用PBS冲洗3次每次5分钟。如需要,可在含1% H2O2 的PBS溶液中孵育5分钟,以除去内源的过氧化物酶活性。用PBS清洗固定的细胞3次,每次5分钟。

      2. 用抗体稀释液制备适宜浓度的一抗溶液。移去细胞上的缓冲液。加入足够量的一抗使其覆盖细胞。室温下孵育一抗60分钟。如果一抗与抗原的亲和力较低,可于4oC下过夜孵育。移去一抗溶液。用PBS清洗3次,每次5分钟。

      3. 移去细胞上的缓冲液。加入稀释的生物素化的二抗,室温下孵育30分钟。最佳的稀释度每个批次二抗有所不同。用PBS清洗3次,每次5分钟。

      4. 移去细胞上的缓冲液。加入稀释的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶,室温下孵育30分钟。移去溶液。 用PBS清洗3次,每次5分钟。

      5. 移去缓冲液。加入DAB底物,孵育大概10分钟或者直到反应颜色足够深。

      6. 移去溶液。用蒸馏水清洗3次,每次2分钟。用苏木精复染色,根据浓度和所需颜色深度的不同,染色1至5分钟。用蒸馏水清洗3次,每次2分钟。用100%的乙醇给细胞脱水4次,每次2分钟。用二甲苯清洗细胞4次每次2分钟。加入2~3滴固定介质,固定好盖玻片使之风干。

      7. 在显微镜下观察细胞。阳性反应应是可见的棕色沉淀。细胞核应显浅蓝色。


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